представляю информацию по реабилитации инвалида-колясочника, спинальника и др. на
 
 
Меню
Раздел Медицинская реабилитация
Реклама
         
 Главная
 Библиотека
 Видеоматериалы
 Законодательство
 Мед. реабилитация
 Проф. реабилитация
 Соц. реабилитация
 Дети-инвалиды
 Советы по уходу
 Образование
 Трудоустройство
 Физкультура
 Инваспорт
 Автотранспорт
 Инватехника
 Творчество
 Знакомства
 Секс
 Персональные сайты
 Сайты организаций
 Консультации
 
Поиск по сайту
 

Программы
 
Программы для работы с сайтом: Download Master, WinRar, STDU Viewer и форматы книг. Подробнее...
 
Объявления
 
 
Помощь сайту
 
WebMoney-кошелёк R102054310579
  Яndex-кошелёк 41001248705898
 
Мой баннер
 
Информация по реабилитации инвалида-колясочника, спинальника и др. - информация для инвалида-колясочника.
 
Ваш баннер
 
Рейтинг@Mail.ru
Tatarstan.Net - все сайты Татарстана
Rambler's Top100
 
 

Нейротрансплантация в лечении травмы спинного мозга

Станков Д.С., Катунян П.И., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А.

This article is a review about pathogenesis of neurological irreversibility at hard spinal cord injury and opportunities of their treatment by transplantations methods. There were presented the data on transplantation of peripheral nerves, Schwann cells, olfactory ensheathing cells and embryonic cells. A special attention was given to transplantation of neuronal stem cells and other neuronal cell lines. There was discussed on opportunity of using transdifferentiated marrow stromal stem cells for repair of damaged spinal cord.

В обзоре представлены данные о патогенезе необратимых последствий травмы спинного мозга и о возможностях нейротрансплантационных методов лечения. Представленны данные по трансплантации периферического нерва, Шванновских клеток, обкладочных клеток ольфакторной области и стволовых клеток. Особое внимание уделено трансплантации нейрональных стволовых клеток и нейрональных клеточных линий. Обсуждается возможность применения трандифференцированных стволовых клеток костного мозга для восстановлени поврежденного спинного мозга.

Тяжелая травма позвоночника, осложненная повреждением спинного мозга в виде его компрессии, размозжения, частичном или полном разрыве, остаётся одной из актуальных медико-социальных проблем современной медицины, т.к. ведёт к глубокой инвалидизации пострадавших. По данным Blumer и Quine частота возникновения этого вида травмы в разных странах колеблется от 11 до 112 человек на 100000 жителей [27], а последствия её проявляются вялым или спастическим параличом, в лучшем случае парезом конечностей и дисфункцией тазовых органов. В настоящее время не существует действительно эффективных методов лечения травматического повреждения спинного мозга, особенно когда после травмы прошли месяцы и годы. Даже, несмотря на раннее использование современных препаратов ноотропного, холиномиметического, сосудорасширяющего действия [113], кортикостероидов [30], блокаторов цикло-оксигенызы-1 [57], различных регуляторных пептидов [41], переносчиков кислорода в ткани – перфторана [3] и т.д., возвращение утраченных функций спинного мозга не удается достигнуть. Применение методов электростимуляции мышц конечностей и стимуляции функций тазовых органов, для предотвращения развития в них нейродистрофических изменений после травмы [95], также позволяет достигнуть лишь некоторого ослабления клинических проявлений – последствий травматического повреждения спинного мозга: развившиеся параличи и органные дисфункции обычно остаются резистентными к применяемым лечебным воздействиям [113].


Патогенез необратимых неврологических расстройств при травме спинного мозга

Полагают, что задержка регресса клинических проявлений травмы спинного мозга связана с крайне низким восстановительным потенциалом нервной ткани, а также с тем, что нейрогенез, т.е. формирование нервных клеток, уже завершается к моменту рождения, после которого новые нейроны практически не образуются [8]. Принято считать, что нейроны ЦНС не обладают митотической активностью, т.к. чётко установлена неспособность их к репликационному синтезу ДНК, как в процессе постнатального развития, так и при интенсификации регенеративной реакции [9], за исключением нейронов коры ольфакторной области. Между тем, было установлено, что нейроны головного и спинного мозга не лишены способности к регенерации своих отдельных структурных элементов, что осуществляется путем гиперплазии ядерных и цитоплазматических органелл [9].

За последние 10 лет в подтверждение данных Aguayо [12] получен ряд фактов, показывающих способность нейронов, в том числе и центральных, к регенерации своих аксонов [26, 58]. Вместе с тем, неспособность нейронов индуцировать удовлетворительную регенерацию своих аксонов после травмы связывают не столько с принципиальной невозможностью регенерации в ЦНС, сколько с наличием в ткани спинного мозга естественных молекулярных механизмов сдерживания спрутинга поврежденных аксонов.

До конца 80-х годов торможение восстановительных процессов в нервной ткани при травме спинного мозга связывали с глиальным рубцом, который препятствует прорастанию аксонов [113]. Позднее, с совершенствованием техники исследования в данной области, ингибиция и блокирование спрутинга аксонов стали объяснять ранним развитием в зоне травмы дисбаланса тканевых пептидов - дефицитом белковых ростстимулирующих нейротрофических факторов и опережающим появлением белков - ингибиторов роста аксонов, таких как - ингибитор нейронов IN [35, 92, 19, 95, 91], ингибитор Nogo - разрушающий конус роста аксонов [36, 52, 102, 86, 49, 21], а также ряда других ингибиторов роста аксонов [58]. Таким образом, в вопросе индукции регенерации и восстановления проводящей функции спинного мозга собрано в сложном комплексе множество противоречивых для нашего понимания патофизиологических и биохимических событий, каждое из которых играет свою исключительную роль.

В результате сочетанного воздействия факторов деструкции и регенерации зона травмы спинного мозга последовательно проходит через несколько этапов формирования необратимого структурного повреждения [5].

В начальный период, от момента травмы до ~ 24 часов, вслед за механическим, первичным повреждением ткани спинного мозга, уже через несколько минут начинается этап вторичного метаболического повреждения. Здесь играют роль механизмы и ишемического повреждения вследствие нарушения спинального кровообращения, тромбоза, спазма и нарушения проницаемости капилляров вокруг очага первичной травмы, с последующим вазогенным и позднее цитотоксическим отеком ткани мозга [51]. Зона повреждения и гибели вещества мозга расширяется за счет высвобождающихся протеолитических ферментов, поступления ионов Са2+ в нейроны и глиальные клетки, активации ПОЛ, и таких процессов, как гидролитическое расщепление белково-липидных структур [57]. Высвобождение простаноидов, метаболитов арахидоновой кислоты - лейкотриенов, тромбоксана, простогландинов, а также нейтрофильная инфильтрация, сопровождающаяся выбросом в ткань миелопероксидазы и эластазы, расширяют ареал повреждения с формированием в соседних с первичной травмой участках спинного мозга новых очагов некроза в его строме и паренхиме [57]. Позднее (более 24 часов до 7 суток) зона травматического некроза, заполненная детритом очищается макрофагами и нейтрофилами, а также за счёт развития гиперплазии микроглиоцитов, астроцитов, появления дренажных форм олигодендроцитов, а также новообразования сосудов. Выше и ниже места травмы продолжается хроматолиз и гибель отдельных нейронов за счет апоптоза. На некоторых нервных волокнах появляются колбы роста. Завершающий этап продолжается до трёх месяцев и более, когда происходит окончательная организация дефекта путём формирования глиального рубца, за счет гиперплазии микроглии и астроцитов, с частым формированием посттравматической кисты. В этот период морфологические исследования продолжают манифестировать разрастание аксонов на несколько миллиметров в сторону или вглубь рубца с конусов роста на концах. На этом этапе, формируется кортикальная дезорганизация мотонейронов коры больших полушарий [53]. Завершается рубцовая организация бывших очагов некроза, происходит окончательное формирования кист в зоне повреждения.


Большой и необратимый фукциональный урон в виде пара- или тетраплегии причиняемый больному в результате осложненной травмы позвоночника, кардинально не соответствует очень малому объему поврежденной ткани спинного мозга - 2-3 кубических сантиметра, порой даже меньше. Столь малый объем тканевого ущерба естественно побуждает восполнить его, опираясь на опыт трансплантации других органов и тканей.

В самом начале 20 века возникло предположение о возможности устранения структурных поломок и восстановления контактов между нейронами путем трансплантации нервной ткани в зону повреждения [1, 2]. Возможность устранения асинопсии связывают с возникновением контактов собственных и трансплантированных нервных клеток, со спрутингом аксонов хозяина сквозь трансплантат, с выделением трансплантированными клетками регулирующих факторов. К настоящему времени накоплен опыт нейропластики дефектов нервной ткани путем трансплантации периферического нерва, эмбриональных нервных клеток, эмбриональных стволовых клеток, нейрональных стволовых клеток.


Трансплантационные методы восстановления поврежденного спинного мозга

Пересадка периферического нерва

Впервые периферический нерв для восстановления поврежденного спинного мозга был использован Tello еще в 1911 г [99]. Для этого на модели ушиба спинного мозга у щенков он трансплантировал кожный нерв бедра. Нерв подшивался к твердой мозговой оболочке выше и ниже места ушиба. Данных о восстановлении функции не приводится.

Позже Sugar O и Gerard RW (1940) [97] попытались восстановить спинной мозг крысы после полного пересечения. В качестве трансплантата использовался седалищный нерв, который был пришит к твердой мозговой оболочке ростральной и каудальной культи спинного мозга. Данных о восстановлении функции в этой работе также не приводится, хотя при гистологическом исследовании в зоне трансплантации был обнаружен спрутинг аксонов реципиента. Подобные, исследования с пересадкой периферического нерва были проведены и другими авторами в середине двадцатого столетия [22, 43].

В 1977 году Kao [63] с соавторами трансплантировал участок седалищного нерва в область перерезки спинного мозга у щенков. Для доказательства регенерации спинного мозга использовалась электронная микроскопия, с помощью которой было показано, что аксоны хозяина развиваются, проникая сквозь прижившуюся часть пересаженного нерва. При этом данных о восстановлении функции не приводится.

В 1996 году Cheng H [37] использовал современные технологии при пересадке периферического нерва на модели перерезки спинного мозга крысы на уровне грудного отдела позвоночника. В качестве периферического нерва использовался межреберный нерв на сосудистой ножке. Трансплантат был пришит концами к твердой мозговой оболочке ростральной и каудальной культи спинного мозга, причем места соприкосновения нерва и спинного мозга были обработаны клеем из фибрина с добавлением кислого фактора роста фибробластов (FGF acid). Несмотря на использование современных достижений медицины и биологии достичь восстановления функции спинного мозга не удалось.

Трансплантация Шванновских клеток

Известно, что Шванновские клетки продуцируют миелин, а также составляют основу оболочки аксонов, выделяют различные нейротрофические факторы: фактор роста нервов (NGF) [20], нейротрофический фактор, синтезируемый в головном мозге (BDNF) [11] и реснитчатый нейротрофический фактор [44]. Эти факторы, также как внеклеточные матричные молекулы [34], могут играть значительную роль в аксональной регенерации. Значение нейротрофических факторов, выделяемых Шванновскими клетками, было изучено в эксперименте. Так культура Шванновских клеток, выделенных из седалищных нервов крысы, была пересажена в зону повреждения, созданную путем моделирования неполной перерезки спинного мозга в грудном отделе позвоночника [112]. При гистологическом исследовании были обнаружены признаки регенерации аксонов только в области трансплантации. При этом не имелось никаких доказательств аксональной регенерации ростральнее и каудальнее места трансплантации [112]. Между тем исследование Chen [111], выполненное на той же модели, демонстрирует не только обширную регенерацию спиномозговых аксонов ростральнее и каудальнее зоны повреждения, но также и ограниченный спрутинг аксонов в каудальный конец трансплантата. Эти наблюдения были подтверждены в других исследованиях [69], показавших выживание и интеграцию трансплантированных Шванновских клеток с окружающими тканями спинного мозга хозяина. Несмотря на положительные гистологические результаты, по мнению Martin [72] не существует пока убедительных доказательств наличия спрутинга аксонов хозяина сквозь трансплантат [72], т.к. никем не показано восстановление функции спинного мозга у экспериментальных животных.

Дополнительное введение нейротрофических факторов через мини-насос в область трансплантации Шванновских клеток увеличивало число миелинизируемых волокон в зоне трансплантации. Чтобы увеличить свойственную Шванновским клеткам способность выделять нейротрофические факторы, в эксперименте стали использовать генетически модифицированные Шванновские клетки [74, 104, 93, 106]. Было показано, что ген-модифицированные трансплантаты Шванновских клеток спонтанно образуют скопления в пределах спинного мозга и вызывают увеличение роста аксонов, а также ремиелинизацию, по сравнению с немодифицированными клетками [106]. На модели полного пересечения спинного мозга крысы было продемонстрировано, что трансплантация человеческих Шванновских клеток также ведет к ускорению аксональной регенерации. При этом наблюдалось некоторое восстановление функции паретичных конечностей [54].

Пересадка обкладочных клеток обонятельной зоны коры головного мозга

Другая группа миелин-формирующих клеток - обкладочные клетки обонятельной зоны коры головного мозга - также используются в нейротрансплантации. В отличие от Шванновских клеток, обкладочные клетки обонятельной зоны коры локализуются в ЦНС и поддерживают рост аксонов от обонятельной луковицы [42]. Обкладочные клетки обонятельной зоны коры миелинизируют аксоны в культуре [39]. Li и соавторы [68] пересадили суспензию культивированных обкладочных клеток обонятельной зоны коры в спинной мозг взрослой крысы в область неполного рассечения его на уровне шейного отдела позвоночника. Было установлено, что клетки трансплантата миелинизировали часть аксонов, функция пораженных конечностей улучшилась у животных с трансплантацией, тогда как в группе контроля улучшения не наблюдалось. Восстановление функции, при трансплантации обкладочных клеток обонятельной зоны коры было подтверждено и в других исследованиях [87, 88]. Возможность значительной ремиелинизации демиелинизированного спинного мозга крыс после трансплантации в него человеческих обкладочных клеток была показана также в работе Kato [64]. Все эти исследования вселяют надежду на возможность и целесообразность применения обкладочных клеток обонятельной зоны коры с лечебной целью.

Трансплантация эмбриональных клеток головного и спинного мозга

В течение последнего десятилетия был накоплен значительный опыт по пересадке эмбриональных клеток для восстановления функции спинного мозга [7]. Были установлены оптимальные сроки для забора эмбрионального мозга (7-9 неделя) и трансплантации эмбриональных клеток [96]. Так было показано, что при трансплантации эмбриональных клеток коры и спинного мозга крысам (взрослым и новорожденным) с повреждениями спинного мозга в период до семи дней от момента травмы, имеет место сохранение пересаженных нейронов. Если клетки пересаживали после 7 дней, то выживаемость их уменьшилась.

Показано, что крысиная зародышевая неокортикальная ткань способна развиваться и дифференцироваться в нормальные нейроны в поврежденном спинном мозге крысы [38]. Было установлено [24], что уже спустя 7 дней после трансплантации в зоне трансплантации выявляются дифференцированные нейроны и нейроглия. Имеются данные по клеточной миграции донорских клеток: трансплантированные астроциты были идентифицированы дистальнее места пересадки до 3.5 см [50].

Вследствие того, что гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) спинного мозга при травме нарушается [85], трансплантат, пересаженный в место повреждения спинного мозга, постепенно вовлекается в реакцию иммунного ответа. Несмотря на это, трансплантированные клетки интегрируют с тканью хозяина и пролиферируют, заполняя область повреждения [101]. Использование иммунносупрессии позволяет уменьшить иммунную реакцию на трансплантат [23]. Исследованиями Homer и соавторов было показано, что использование гамма-аминоизобутириковой кислоты при пересадке эмбриональных клеток не вызывает значительного повреждения ГЭБ, но при этом в области трансплантата происходит значительное уменьшение проницаемости ГЭБ [56]. Приведенные результаты указывают на возможность использования кратковременной иммунносупрессии после трансплантации, поскольку вместе с развитием трансплантата, восстанавливается и целостность гематоэнцефалического барьера.

Несмотря на наличие доказательств о выживании трансплантата и о функциональном восстановлении после трансплантации фетальной ткани [4, 31, 33, 46, 65, 89], ряду авторов не удалось обнаружить спрутинг аксонов хозяина сквозь трансплантат больше чем на 1-2 мм в каудальную часть спинного мозга [18, 32, 61, 78]. Напротив, результаты пересадки эмбриональных клеток новорожденным щенкам при травме спинного мозга показывают, что нисходящие аксоны проникают через трансплантат и протягиваются дистальнее от места трансплантации более чем на 4 мм [25, 40, 75]. Имеется также доказательство, что трансплантация эмбриональных клеток на модели полной перерезки спинного мозга у новорожденной крысы улучшила функциональное восстановление по сравнению с контролем [100]. Эти данные свидетельствуют о том, что окружающая среда развивающегося спинного мозга также способствует не только выживанию трансплантированных клеток, но и восстановлению их контактов со спинным мозгом реципиента.

Возможности ксенотрансплантации, с помощью эмбриональных клеток спинного мозга человека также изучали на модели травмы спинного мозга крысы [13, 47, 48]. После трансплантации на модели ушиба, человеческие эмбриональные клетки спинного мозга были идентифицированы иммуногистохимически спустя 2-3 месяца [73]. В качестве трансплантата использовались тканевые (твердые или солидные) трансплантаты и суспензия эмбриональных клеток. При этом было показано, что тканевые трансплантаты, помещенные в область повреждения, в острой фазе имели выживаемость 83%, тогда как при трансплантации в позднем периоде после повреждения спинного мозга (14-40 дней после травмы) выживаемость составила 92% [48]. При использовании суспензии клеток в позднем периоде травмы выживание составило 85%. Эти исследования указывают на тот факт, что выживаемость человеческих эмбриональных клеток при трансплантации, а также дифференцировка и интеграция этих клеток зависят от выбора времени трансплантации и типа трансплантата (тканевой трансплантат или суспензия клеток).

Трансплантация нейрональных стволовых клеток и других нейрональных линий клеток

В последние годы стали интенсивно изучаться свойства различных типов стволовых клеток и возможность их применения в медицине, в частности при болезнях ЦНС [45, 81, 98, 109]. На моделях травмы спинного мозга (ТСМ) было показано, что нейрональные региональные стволовые клетки могут выживать, интегрироваться с мозгом хозяина, а также и дифференцироваться в нейроны и глию [70, 71]. Развитие и дифференцировка трансплантированных нейрональных стволовых клеток (выделенных из эпендимиальных оболочек) совпадала с восстановлением функции экспериментальных животных с ТСМ [70]. Было высказано предположение, что плюрипотентные свойства нейрональных стволовых клеток позволяют использовать их в качестве источника донорских клеток для трансплантации при травме спинного мозга.

Vacanti C.A также использовал региональные нейрональные стволовые клетки, выделенные из спинного мозга крысы. Клетки пересаживались в геле из плюроника P-200, при этом трансплантат во время операции закрыл диастаз перерезанного спинного мозга длинной 4 мм. В группе животных с трансплантацией нейрональных стволовых клеток наступило восстановление функции задних конечностей, тогда как в контрольной группе существенных изменений не произошло [105].

Из линии клеток, человеческой тератокарциномы (hNT клетки от Layton Bioscience Inc) после воздействия ретиноевой кислотой была получена гомогенная популяция нейрональных клеток предшественников NT2N [14]. Это клетки (NT2N) характеризовались стабильностью нейрохимических, физиологических и морфологических свойств в культуре [10, 15, 16, 67, 79, 83, 84, 114]. NT2N клетки были успешно пересажены в мозг иммунодефицитных мышей, хорошо прижились, не образовывали опухоли, не отторгались, не некротизировались и не подверглись апоптозу в течение одного года [55, 66, 76, 77]. Более того, было показано, что пересаженные NT2N клетки, интегрировали с окружающей нейрональной тканью хозяина, посредством дендритных и аксональных отростков [103]. Эти клетки были использованы на животных моделях, имитирующих следующие неврологические состояния: инсульт [28, 29, 90], болезнь Гентингтона [60], болезнь Паркинсона [17] и нейротравма [82]. Недавно, показано, что трансплантированные NT2N клетки интегрируют с клетками хозяина в спинном мозге мыши и дают спрутинг аксонов на протяжении более чем 2 см [54]. Использование в клинике NT2N клеток сдерживается потенциальной возможностью малигнизации этих клеток.

Другая нейрональная линия стволовых клеток RN33B была получена из ядер шва эмбрионального мозга крысы. Эти клетки были трансфецированы ретровирусным вектором, несущим ген, кодирующим температурно чувствительный мутантный протеин SV40 большого T-антигена [109]. На модели ушиба спинного мозга крысы было продемонстрировано, что пересаженные после трансфекции клетки развиваются и дифференцируются в биполярные нейроны [80], а также интегрируют с окружающей тканью спинного мозга хозяина [80, 109]. К сожалению подобных попыток применения этих клеток в клинике не было из-за развития хромосомных аберраций в эксперименте [109].

McDonald и соавторы использовали линию эмбриональных стволовых клеток D3, обработанных ретиноевой кислотой, для трансплантации в область повреждения спинного мозга крыс [71]. Перед трансплантацией клетки были трансфецированы LacZ, экспрессирующим гамма-галактозидазу. Спустя две недели, методом двойного окрашивания были обнаружены пересаженные клетки. При этом было показано, что трансплантированные клетки окрашиваются также специфическими маркерами на нейроны (NeuN - нейрон-специфический ядерный протеин), астроциты (GFAP- глиально-фибрилярный кислый протеин), олигоденроциты (APC CC-1 - аденоматозный полипозный генетический продукт палочек). В группе животных с трансплантацией клеток было выявлено некоторое улучшение функции паретичных конечностей по сравнению с контролем.

Трансплантация модифицированных стволовых клеток костного мозга.

Наряду с вышеперечисленными типами клеток для нейротрансплантации (эмбриональные стволовые клетки, нейрональные стволовые клетки, модифицированные линии клеток), мезенхимальные стволовые клетки костного мозга так же рассматриваются, как потенциальный источник клеток для пересадки в поврежденный спинной мозг [62].

Стромальные клетки костного мозга способны дифференцироваться в адипогенном, хондрогенном, миогенном, остеогенном и кардиомиогенном направлении, а также в другие ткани, которые имеют общее мезодермальное происхождение [62]. В исследовании Jun Kohyama [62], было показано, что нейрональную дифференцировку, можно получить из клеток стромы костного мозга при культивировании в среде со специфическими индукторами, на подложке из фибронектина и орнитина. Нейроны и глия, полученные из костномозговой стромы, формировали аксоны, экспрессировали нейрон-специфические маркеры (MAP-2, NF, Nestin, GFAP) и отвечали на деполяризующие стимулы, как функционирующие зрелые нейроны. Трансдифференцировка клеток стромы костного мозга в этом эксперименте была вызвана Noggin-агентом.

Идея использования Noggin-агента для трансдифференцировки стромальных клеток костного мозга аналогична идее обработки клеток 5-азацитидином - препаратом, способствующим изменению экспрессии генов путем диметилирования ДНК.


Заключение

Усиленное развитие современных биомедицинских технологий, освоение методов культивирования соматических (эмбриональных) и стволовых (региональных) клеток, а также модифицированных клеточных линий, открыли перспективу для изучения возможностей заместительной клеточной и тканевой терапии последствий травмы спинного мозга.

Между тем на путях изучения возможностей метода клеточной трансплантологии стоит ряд проблем, связанных, прежде всего с получением адекватного донорского материала. Донорские клетки должны: обладать высоким донорским потенциалом, дифференцироваться в нейрональном направлении, не подвергаться малигнизации и не вызывать иммунной агрессии со стороны реципиента. Получение клеток в достаточном количестве не должно иметь ограничений этического и юридического порядка. Кроме того, трансплантированные клетки должны интегрироваться спинным мозгом реципиента и индуцировать спрутинг для устранения асинопсии и восстановления функции поврежденных органов. Наш анализ современной литературы показал, что этим требованиям в наибольшей степени может соответствовать аутологичный костный мозг больных с травмой спинного мозга.

Трансдифференцировка мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в нейрональном направлении и их ранняя трансплантация в зону повреждения может оказаться наиболее оптимальным способом хирургического восстановительного лечения больных с тяжелой травмой спинного мозга.



Популярные материалы Популярные материалы





Облако тегов Облако тегов

 
 
Советую прочитать
 
 
Следите за нами
 
В Контакте Facebook Twitter Livejournal YouTube
 
Случайный анекдот
 
 
Другие проекты сайта
 
 
 
 
 
Создан: 02/28/2001.
Copyright © 2001-aupam. При использовании материалов сайта ссылка обязательна.